作者介紹

Niels K. Jerne

1911–94, British-Danish 免疫學家, b. London.在the Danish State Serum Institute工作(1945–55) ,為世界衛生組織首席官員(1956–62).他發展 “network theory”解釋人類免疫系統產生抗體對抗疾病的互動過程.(3.4.5)

Georges J.F. Kohler

1946–95, German免疫學家, Ph.D. Univ. of Freiburg, 1974.他和Cesar Milstein (1974–76) 在the Laboratory of Molecular Biology in Cambridge, England. 工作, 在哪裡他們發展一項技術藉由融合產生抗體的細胞和快速生長的細胞因而產生大量的單株抗體,這項產生抗體的技術被全世界廣泛的接受. (3.4.5)

Cesar Milstein

1926–2002, Argentine 免疫學家, Ph.D. Cambridge Univ., 1960.他和 Georges Kohler (1974–76) 工作在the Laboratory of Molecular Biology in Cambridge, England.他們製造單株抗體來對抗特殊的細胞. 這項產生抗體的技術被全世界廣泛的接受. (3.4.5)

單株抗體(2.3)

抗原分子上可以誘導出抗體的部位或片段，特稱之為 抗原決定基 (antigenic determinant)；一個抗原分子上通常都有許多處抗原決定基，而每個決定基至少都可誘生出一種抗體；因此在傳統抗血清中，都含有許多種不同的抗體，分別對抗這些不同的決定基。

對於分子構造相似的抗原，由於它們含有共同或相似的抗原決定基，所產生的抗血清對這兩種相似的抗原都會產生反應；因此在檢定此類抗原時，其 專一性 不很理想，常常會出現假陽性，也稱為 交叉反應性。 同時又由於免疫動物的個別體質不同，對抗原的反應也有相當的差異，以致無法準確控制所得到每批抗血清 效價 的高低。

血清中的每一種抗體是由單一種 B 細胞 所分泌產生，若能把此 B 細胞由脾臟中挑出來，單獨培養成細胞株，則可得單一種類的抗體，只會對一種 抗原決定基 反應，其專一性極高。 大量培養此細胞株，即可有品質一定、純度均一的抗體，此即為 單株抗體。

然而 B 細胞不易在培養基中生長，雖然有人一直努力，想找出在體外培養脾臟細胞的條件，但結果均不甚理想，因此上述想法不易達成。

癌細胞 的生長不受控制，很容易在培養基中生長，有很多已經建立好的癌細胞株，其生長特性均已了解； 若把癌細胞永續生長的特性，利用細胞融合法導入可生產有用抗體的 B 細胞中，則得到可在培養基中永久生長的 B 細胞株，此即 融合瘤 細胞株。

廣義來說，細胞融合也可說是 基因重組 的一種方式，它是以融合兩種不同遺傳特性的細胞，來達成改變遺傳形質的目的。 另外，微生物或植物的細胞，亦可以 原生質體 的形式互相融合，以改變其遺傳性質。

Hybridoma技術是70年代生藥界最重要產生單株抗體的研究方法之一,很久以前科學家就在想如何讓細胞不斷的產生抗體.1975年,這個想法被Georges Jean Franz和Cesar Milstein實現,藉著融合癌細胞和可產生抗體的細胞,Hybridoma產生單株抗體,這個方法讓單株抗體無限的產生,因而打開理論和生藥研究新領域並提高疾病診斷和治療的準確性.

1955年，Niels K. Jerne 便提出著名的免疫天擇論，指出每個人體內都具有大量各式各樣的抗體；當外來抗原進入人體時便會選擇最適合的抗體來反應（也就是結合），而此一新結合的抗原抗體分子，又會刺激人體生產更多同類型的抗體。換言之，抗原在免疫反應裡的作用彷彿模板，可供人體打造大量相對應的抗體。這個說法推翻了早先學界流行的想法，奠下現代免疫學的理論基礎，同時也成為Burnet（Macfarlance，1960年諾貝爾生理醫學獎得主）的選殖（clone）理論的前導。

1969年，Niels K. Jerne前往瑞士，擔任巴塞爾免疫研究所所長。這段期間，它又把多年研究心得整理出兩大理論，一是關於免疫細胞生成機制的詮釋，另一個則是重要的網路理論（network theory），而後者正是讓他獲得諾貝爾獎的主因。這兩個重要的理論分別是在1971及1974年提出，從此改寫免疫學理的基礎。

1974年春天，二十八歲Georges Jean的剛從瑞士的巴塞爾免疫學院得到博士學位，他選擇了由Cesar Milstein負責的英國劍橋大學分子生物研究室，繼續博士後研究。

Georges Jean的博士論文是研究抗體的基因突變，而Cesar Milstein則是一直從事抗體遺傳學的研究，他與Cotto曾將大鼠（rat）與小鼠（mouse）的淋巴細胞融合在研究抗體的產生情形，他同時也探討基因突變後抗體受到的影響。

骨髓瘤是漿細胞的腫瘤細胞，可以產生大量對抗單一抗原的抗體。當時在美國國家癌症研究院的Potter，已在小鼠腹腔中誘導出了許多骨髓瘤，但這些細胞還無法在試管中培養，而且沒有簡單的方法可以找到這些骨髓瘤細胞所分泌的抗體是針對何種抗原。有一株骨髓瘤，稱為MOPC 315，可以與一已知抗原作用，這正是柯勒理想中的實驗材料，所以柯勒決定嘗試培養MOPC 315，但是並沒有成功。

Georges Jean開始找另一個題目，他向Cesar Milstein建議，要將兩種不同的骨髓瘤融合起來，在看看是哪種抗體會分泌出來。此時，最熟悉細胞融合的柯頓以回到了澳洲，Georges Jean只好開始學習細胞融合，最後，他成功的將P3和P1兩種骨髓瘤融合，並且得到了能產生兩種抗體的融合瘤。

1974年Cesar Milstein建議，Georges Jean針對P3抗體來篩選抗原。此時P3已培養成功，如能找到抗原將是研究抗體遺傳學最好的實驗工具了。但這是一件費時費力且十分單調的工作。

其實，Georges Jean心中仍念念不忘他心中的第一個夢想：如何得到一個能製造指定抗體的細胞？柯勒一直在想，如果能製造一種針對某一特定抗原的骨髓瘤，不就可以免除此費時、費力的篩選工作了嗎？

Georges Jean的主意是要將一個正常的淋巴細胞與骨髓瘤細胞融合，創造出一個融合的細胞，這個細胞既承襲了骨髓細胞永久生長的性質，又具備了淋巴細胞產生抗體的特性，所以可以不斷在試管中生長並分泌特異性抗體。

Georges Jean的實驗是用綿羊紅血球作為抗原，骨髓瘤用的是P3細胞。細胞融合後幾天，他從瓶子中就看到融合細胞在生長，但最關鍵性的實驗是看看這些融合細胞是否會分泌抗紅血球的抗體。這時，已到了1974年底了，柯勒決定去做一個溶血斑試驗，當他拿起兩個培養皿看見溶血斑時，世界上第一個融合瘤誕生了。

所有動物都具有免疫系統，能夠把它認為不屬於自己的蛋白質當成敵人來消滅。凡是看起來具有威脅性的東西，不論是何方神聖，病毒、細菌、真菌，甚至只是其他動物體的一個蛋白質分子，都可以觸發免疫系統。免疫系統身為威力強大的防禦網，始終處在一觸即發的狀態，隨時都製造有數千種抗體在體內四處巡查，一發現入侵者，馬上拉警報。

Cesar Milstein和Georges Jean的研究，正是利用這個警報系統來抗癌。他們培養出所謂的融合瘤（hybridoma），也就是讓癌細胞與製造抗體的Ｂ細胞相融合。由於癌細胞在人工培養環境中可以不斷生長，所以融合瘤也可以長生不老。於是，科學家可以藉由變換Ｂ細胞的種類，來製造想要的抗體，而且是不限量製造。又因為免疫系統具有內建的基因置換機制（gene-shuffling mechanism），能夠變換組合出好幾百萬種抗體，每一種抗體都是專為識別、捕捉某特定蛋白質而量身訂做的。因此，科學家可以針對會刺激血管朝腫瘤生長的因子，設計出相對的抑制劑做為藥物。

目前常用細胞融合方法(1)

利用 polyethylene glycol (PEG) 進行小白鼠 脾臟細胞 與 骨髓癌細胞 的融合，經過 篩選 及 單株化 後，可得到分泌有單株抗体的融合瘤細胞。

a.小白鼠免疫及脾臟細胞：

1) 小白鼠 (BALB/c) 先以 目標抗原 (如菌體) 免疫，2) 抗原需加 佐劑 (adjuvant, 如 TiterMax) 製成乳劑，3) 打入小鼠體內 慢慢釋出 (免疫流程)，4) 誘使 B 細胞成熟增殖並生產抗體，5) 然後取出脾細胞 (大多為 B 細胞) 與6) 骨髓癌細胞進行細胞融合。

2?) 注意乳劑的生產要完全，可取小量滴入水中，震動後應該不會散去。 也可以在 電泳後，切出所要色帶，膠體裝入乳化針筒，加入佐劑 直接製成乳劑，可有相當好的免疫效果。

3 ) 有人直接取出健康的脾細胞，在培養中加入抗原進行體外免疫；或打開腹腔直接在脾臟注射抗原免疫。 近來更流行以抗原的 DNA 種入肝臟中，以此 DNA 的表現產物，直接在生物體內誘發免疫反應。 但除非抗原來源困難或有其它目的，我們仍採行舊法，因免疫反應的啟動機制非常複雜，生物整體的免疫反應還是最可靠。

b.骨髓癌細胞 (NS-1)：

NS-1 是穩定的小白鼠 BALB/c 癌細胞株，除了能在培養基中永續生長外，尚有一重要特性，其細胞缺乏兩種核酸代謝的重要酵素 (TK, thymidine kinase 及 HGPRT, hypoxanthine-guanine phospho ribosyltransferase)。一般細胞內的核酸合成路徑有兩條:

核酸的? 正常代謝途徑? 若被 aminopterin 阻礙，可由? 救急途徑? (salvage pathway) 取用 thymidine 及 hypoxanthine 來合成 DNA。但 NS-1 缺乏 TK 及 HGPRT 兩種酵素，因此在 aminopterin 存在下， NS-1 無法生長；正常細胞 (如 B 細胞) 則可經由救急途徑繼續生長。HAT 培養基含有 aminopterin, thymidine 及 hypoxanthine，NS-1 在 HAT 中無法生長，除非經由細胞融合導入 TK 及 HGPRT 兩酵素的基因 (可由正常脾臟細胞得來)。

c.細胞融合：

小白鼠脾臟細胞 B 與 NS-1 細胞 N 以 PEG 進行融合，操作在 10 min 內完成，隨即把細胞平均分配在 96 槽細胞培養盤中。 由於融合是隨機的，故可能的組合有：B-N, B-B, N-N, B-B-B, B-B-N....；只有同時含有 B 與 N 的融合細胞才會活下去

d.細胞融合的注意要點：

　 1) NS-1 要健康，在 T-80 培養瓶內生長密度不要超過六成，一瓶 T-80 細胞用在一次融合。脾細胞取出後可以不用除去紅血球，直接以 RPMI 洗三次，要小心自行調整 離心力 不致太大，也不能太小，隨時鏡檢之。

　 2) 要用可靠的 PEG 1500，可使用商品已配置好的溶液，每次 0.7~1 mL；否則自己要試出可用的批次，在高壓滅菌時，儘量縮短滅菌時間 (5 min 足夠)，並且要儘速由滅菌釜內取出。

　 3) 把 NS-1 與脾細胞混合，每次使用一個 T-80 與一個脾臟，幾乎可以不用數細胞數目；在 50 mL 離心管中，小心把細胞離心下來，倒去上清後，以殘留的 RPMI 把細胞打散，放在 37℃內保溫準備加入 PEG。

　 4) 在 2 min 內慢慢加入 PEG，同時一邊輕輕搖動，讓 PEG 均勻地混合細胞。然後在 2 min 內加入 2 mL RPMI，邊加邊混勻；再於 2 min 內，再加 8 mL RPMI。此時鏡檢可看到許多細胞聚合，如上圖的黑白照片；若在融合後 1 h 內看不到很多融合細胞，可能已經失敗。

　 5) 離心去掉上清，輕輕加入 30 mL HAT-RPMI，並均勻懸濁細胞。此步驟最為關鍵，離心力不可過大，以免把融合後的脆弱細胞壓成一塊；若你無法輕易而均勻地把細胞懸濁，可能已經失敗。

　 6) 把細胞放在保溫箱 30 min 後，均分到三片 96 孔培養盤，每槽加約三至四滴，分配要平均。

　 7) 從第二天起就不再用 HAT，改用 HT-RPMI 即可。添加或換培養液時，不要擾動細胞，並且不要在培養相外面放置太久。 第二或第三天鏡檢可以看到很多二元體，是融合後的第一次分裂；這種二元體數目應該很多，培養槽內到處都會冒出來 (約 25 至 50 對)，可以用『雨後春筍』來形容之，否則可能已經失敗。

　 8) 但細胞仍然迅速死亡，最後每槽只剩下一或二個穩定細胞群落，約一週內可以看到如下面彩色圖片所示的細胞堆，此時可以進行 ELISA 篩選。

e.篩選方法：

　 1) 初步篩選： 融合後馬上以 HAT 培養，能活下來的都是上述 B 細胞與 NS-1 的正確融合細胞，但此時細胞的遺傳背景尚未十分穩定。

2)篩選專一性抗體： 並非所有 B 細胞都會產生我們所要的抗體，小白鼠原先就存在許多 B 細胞株對抗一般疾病；因此要用 酵素免疫分析法 (ELISA) 挑出專一性抗體 。　

　 3)單株化： 這樣所挑出來的細胞株，也許仍含有兩群以上的細胞 (為什麼？)，因此要進行單株化；先將該細胞株稀釋，重新平分到 96 槽細胞培養盤中，以計算使得每槽中只含有一個細胞，俟其生長成群落後，再次以 ELISA 篩選專一性抗體。

f.抗體生產：

　 1) 可把挑選出來的融合細胞打入小鼠腹部，誘生腫瘤，然後收集所產生的 腹水，腹水中的抗體濃度非常高，每 mL 可達數 mg。

　 2) 把融合細胞在大型培養槽中培養，收集培養液上清即得抗體，但每 mL 只得約數 mg，濃度較腹水稀約一千倍。最近有一種細胞培養瓶，可產生如腹水般濃度的上清，但價格極為昂貴 (IBS Integra Bioscience: Integra Celline)。

　 3) 所得到的抗體再經純化步驟，以除去雜質，可用下列各種方法的組合︰

1.硫酸銨分劃： 收集約 40% 飽和度的沉澱，是最經濟、方便的方法。

2.離子交換法： 用 DEAE 陰離子交換法，多用在純化 IgG。

3.膠體過濾法： 以分子量的差異分劃出各種抗體，多用在純化 IgM。

4.親和層析法： 以 Protein A-吸著劑 專一性地吸住抗體分子 (IgG)。

參考資料

1.http://www.brc.ntu.edu.tw/~juang/ECX/monoclonal.htm

2. http://home.kimo.com.tw/unibiotech/news.htm

3http://www.nobel.se

4http:///www.nobelchannel.com

5http://www.infoplease.com/ipa/A0777579.html