酵素活性分析

 

一、Beer’s law

 

若某一化學物質可吸收某一波長的光 (H2O2可吸收波長240 nm的光),則該化學物質在溶液中的濃度,會與溶液對該波長的吸光值(absorbance)成一正比關係,因此利用分光光度儀(spectrophotometer) 測定吸光值後,即可推知該化學物質在溶液中的濃度。

 

化學物質在波長l的吸光值(Al; absorbance)定義為Al = log(I0/I)。吸光值另稱為optical density (OD )。吸光值(OD) 只為一個數值,並無單位。 I0 (incident light density): 為分光光度儀所放出波長l的光束強度。I (transmitted light intensity): I0經過溶液及石英管後,所穿透出的光束強度

 

 

 

 

 

 

 


化學物質在波長l的吸光值(Al)與下列兩項因子成一正比關係:

 

(1) 化學物質在溶液中的濃度 ( C; 單位: Mmg/ml )

(2) 所用石英管(cuvette)的寬度(l; 單位: cm )

 

此正比關係稱為Beer’s law (Beer-Lambert law): Al = el C l

 

el:為一比例常數(proportionality constant),稱為該化學物質在波長lextinction coefficient,單位為 mM-1 cm-1 liter mol-1 cm-1等。el 可經由實驗求得,即先配製不同濃度的化學物質,在波長l及固定寬度的石英管中,測定吸光值,即可依實驗所得的數據,求得el。例如,H2O2在波長240 nmel = 0.0395 mM-1 cm-1

 

 

二、抽出液中含有的酵素活性單位:

 

抽出液中含有多種蛋白質,這些蛋白質中,有些則具有某些酵素活性。例如,種子抽出液中,含有多種酵素,其中有一種即為a-amylase。抽出液中,某一種酵素含有多少量,通常以實際的酵素活性表示,常用的單位有兩種:

 

 (a) units/ml表示,即1 ml 的抽出液中含有多少unit (單位)的該種酵素活性。

 (b) unit/mg表示,即抽出液中,每1 mg 的蛋白質含有多少unit (單位)的該種酵素活性,此表示方法,稱為抽出液中所含有該酵素的比活性(specific activity)。對某一酵素而言,抽出液的比活性愈高,則抽出液含有該酵素的純度愈高。

 

(2) 酵素活性單位(unit),指在單位時間(通常為分鐘)內,酵素使受質減少(或產物增加)的量。受質減少(或產物增加)的量,可視實驗的需求或方便性,以莫耳(mole)、克(g)OD吸光值等表示。例如: 1 unit 可表示在一分鐘內,可使受質減少(或產物增加) 1 mmole; 亦可表示為在一分鐘內,可使受質減少(或產物增加) 1 mg; 或可表示為在一分鐘內,可使受質的OD吸光值減少0.1 (或是0.01等等)

 

例如:

O. D.值變化量  

活性 =

(樣品蛋白質含量) X (反應時間-分鐘) 

 

 

三、酵素-催化反應的反應速率單位:

 

酵素反應的速率,以最初反應速率(initial velocity)表示,單位為mmoles/min,亦可以mmoles/liter-min表示。

 

在適當條件[適當溫度、pH 值、及離子強度(ionic strength)],且酵素的受質量很足够 (即最初的受質濃度大於酵素濃度時)的情況下,加入一定量的酵素溶液,則在不同時間後,受質的減少量(或產物的增加量)呈現如下列的圖形中的曲線。在曲線上的每一點的切線(如圖中的1, 2, 3)的斜率,為在該時間的反應速率。因此,在同一個最初的受質濃度,若取不同時間點,則會有不同的反應速率。通常在特定的最初受質濃度下,酵素反應的速率,均以最初反應速率(initial velocity; 即酵素反應開始進行時的速率)表示。因此,在曲線上取的點,若越接近原點,則該點的切線的斜率,越接近最初反應速率,如下圖中,切線1的斜率可視為酵素在某一最初受質濃度之下的最初反應速率。

 

文字方塊: 受質減少量(或產物增加量)
 

 

 

 

 

 

 


四、酵素活性問題及解答:

 

植物組織抽出液,經蛋白質定量後,抽出液含有20 mg/ml的蛋白質。在反應體積為0.5 ml,內含10 ml抽出液,以測定抽出液中酵素A的活性。在適當條件下[適當pH 值、離子強度(ionic strength)、所有受質為飽和濃度等],酵素A一分鐘內,可催化產生3 mmoles 產物。請計算:

 

(1) 酵素-催化反應的最初反應速率(initial velocity)

(1-1) mmoles/liter-min 表示。

(1-2) mmoles/min 表示。

(1-3) 如在標準反應體積1.0 ml下,取10 ml萃取液進行反應,則反應速率為多少
mmoles/liter-min

 

(2) 抽出液中酵素活性(enzymatic activity):

(2-1) 抽出液的酵素A活性,以units/ml 表示,

(2-2) 抽出液的酵素A的比活性,以unit/mg protein 表示。

 

解答:

 

(1)    酵素-催化反應的最初反應速率:

 

(1-1)         mmoles/liter-min 表示。

n = (3 mmoles/min)/0.5 ml = (3 mmoles/min)/0.5 ´10-3 liters

= 3/(0.5´10-3) mmoles/liters-min

n = 6´103 mmoles/liters-min

 

(1-2)        mmoles/min 表示。

n = 3 mmoles/min

 

(1-3)         如在標準反應體積1.0 ml下,取10 ml萃取液進行反應,則反應速率為多少mmoles/liter-min

n = (3 mmoles/min)/1.0 ml = (3 mmoles/min)/1.0 ´10-3 liters

= 3/(1.0´10-3) mmoles/liters-min

n = 3´103 mmoles/liters-min

 

或可以下列方法計算:

因反應總體積加倍,造成酵素濃度減半,因此反應速率(mmoles/liter-min) 將減半。所以

 

n = (3 mmoles/min)/1.0 ml = (3 mmoles/min)/1.0 ´10-3 liters

= (6´103 mmoles/liters-min)/2

n = 3´103 mmoles/liters-min

 

當反應體積增加時,產物總量依然不變。雖然mmoles/liter-min 的反應速率減半但反應總體加倍。因所有的反應均在受質的飽和濃度下進行,每一反應的反應速率為Vmax 值。

 

(2) 抽出液中酵素活性(enzymatic activity):

(2-1) 抽出液的酵素A活性,以units/ml 表示,

 

1 unit 定義:在適當反應條件下,每分鐘催化產生1 mmoles 產物所需的酵素量。因此,反應速率3 mmoles/min 相當於3 units。以10 ml 萃取液產生3 units

酵素A活性= 3 units/10 ml = 3 units/0.01 ml

酵素A活性 = 300 units/ml

 

(2-2) 抽出液的酵素A的比活性,以unit/mg protein 表示。

比活性(specific activity)定義:每毫克(mg) 蛋白質所含酵素units

比活性= (300 units/ml)/(20 mg protein/ml)

比活性= 15 units/mg protein

 

含有catalase的蛋白質溶液中,含有蛋白質的濃度為 0.5 mg/ml,取 200 ml H2O2溶液中,使最後測試溶液的總体積為1 ml,並以分光光度儀(spectrophotometer) 測定OD240。一開始測的OD240 = 0.1,經過一分鐘後,OD240 降至 0.054,請求出含有catalase的蛋白質溶液的catalase的比活性 (mmol/min/mg) (石英管的寛度為1 cm; H2O2在波長240 nmel = 0.0395 mM-1 cm-1)

 

:

1. catalase 催化以H2O2為還原劑,將H2O2還原成H2O的反應: H2O2 + H2O2 -> O2 + 2 H2O

 

2. 含有酵素的蛋白質溶液的比活性(specific activity),以unit/mg表示,
即溶液中,每1 mg 的蛋白質含有多少酵素活性單位(unit)

 

3. 酵素活性單位(unit),指在單位時間(通常為分鐘)內,酵素使受質減少(或產物增加)的量,
單位可為 mol/min

 

解答:

 

1. Beer’s law (Al = el C l)計算一分鐘之內,測試溶液中受質(H2O2)的減少量:


(1)
一分鐘內OD減少值:0.1-0.054 = 0.046

Al = el C l

0.046 = 0.0395 (mM-1cm-1)´C´1(cm)

C = 0.046/0.0395 (mM-1) = 1.165 mM

∴一分鐘內受質(H2O2)減少1.165 mM

 

(2) 測試溶液總體積為1 ml

1.165 (mM) ´1 (ml) = [1.165´10-3 (M)]´[1´10-3 (L)]

= 1.165 ´10-6mole = 1.165 mmole

一分鐘內受質(H2O2)減少1.165 mmole

酵素活性單位(unit) = 1.165 mmole/min

 

2. 計算測試溶液中蛋白質的含量:

 

0.5 (mg/ml)´200 (ml) = 0.5 (mg/ml)´0.2 (ml) = 0.1 mg

溶液中含有蛋白質0.1 mg

 

3. 計算溶液的catalase的比活性:

比活性 (unit/mg) = 1.165 (mmole/min)/0.1 (mg) =11.65 mmole/min/mg