MS蛋白質序列分析

 

 

 

一、質譜儀(MS)如何運作

 

二、MALDI-TOF MS

 

三、MALDI的優缺點

 

四、ESI tandem MS

 

五、Tandem Mass Analyzers

 

六、Ion-Trap Mass Analyzers

 

 

 

一、    質譜儀(MS)如何運作

 

目前有兩種設備用於蛋白質體學的質譜儀(MS)實驗,一種是MALDI-TOF MSmatrix-assisted laser desorption inoization-time of flight mass spectrometry),一種是ESI-tandem MSelectrospray ionization-tandem mass spectrometry),前者可獲得peptide質量的資訊,後者可獲得peptide片段詳細的資料。雖然兩種操作的方式截然不同,但得到的結果都具有高度準確性,專門研究蛋白質體學的實驗室,會將兩種皆列為必要的設備。

 

MS本身有三個主要部份,如下圖所示:

 

 

 

第一個部份是來源(source),由樣品產生離子;第二個部份是質析(mass analyzer),依離子質量/價數【mass/chargem/z)】的比例分開它們;第三個部份是偵測(detector),也就是mass analyzer的結果。簡單說來,質譜儀就是將一群混合物轉為離子,再依照m/z分析它們,得到的結果由儀器自動記錄下來,交給電腦分析。

 

怎樣的MS適合?有三個重點,第一是敏感度(sensitivity),多數的蛋白質體研究中,所能得到的蛋白質量都有限,所以儀器最好能敏感到能偵測10-15莫耳的peptide;第二是解析能力(resolution),從極小的m/z值分辨不同離子,最好能區別m/z值差別在0.001 amu以下的樣品,限於經費,這樣的儀器其實不普遍,常用的大概在1 Da(一個氫原子的質量)左右;第三是精密度(mass accuracy),測得的peptide離子或片段愈接近真實狀況愈好。

 

 

 

二、    MALDI-TOF MS

 

MALDImatrix-assisted laser desorption inoization)代表來源(source),也就是離子化的部份,TOFtime of flight的縮寫,代表質析(mass analyzer),整個運作方式如下:

 

 

 

A:將待測物peptides與一些化學物質(圖中的matrix)混合,matrix中的微小分子,會吸收特殊波長的光,成份包括2,5-dihydroxybenzoicacid3,5-dimethoxy-4-hydroxycinnamic acidsinapinic acid),以及α-cyano-4-hydroxycinnamic acid。混合物置於小玻片上,讓水份或其它溶劑揮發到空氣中,造成樣品內部晶格(crystal lattice)的形成,再把樣品放到source的部份,source這兒提供雷射光,matrix的化學物質吸收光子而激發電子,釋放的能量轉到樣品中的peptide上,離開matrix表面進入空氣中。這樣的離子化過程,依樣品的性質,產生正離子或負離子,在蛋白質體學的研究中,通常正離子是我們所感興趣的部份,正離子的產生是在脫離matrix的過程中,接受了質子所致。每一個peptide分子會接受單一的質子,因此,大部份的peptide離子都會帶一個正電,比如一個質量1032peptide接受了一個質子後,變成【M+H+的狀態,m/z質成為1033。在MALDI形成這樣的離子後,再送入TOF mass analyzer分析。

 

BTOFtime of flight)正如其名,能測得離子由analyzer一端到另一端(detector)的時間,m/z值愈大,時間愈短。MS的優劣是在於能區別離子間微小m/z的差異,但是這種測量直線行進速度的TOF解析力不夠高(以人的眼睛狀況比喻,解析力差的MS就像近視),造成直線型TOF低解析力的原因,在於相同m/z值的離子,直線行進速度也有快慢之別。

 

C:改良式的TOF,以反射取代直線法。它能使離子經反射而聚焦,擁有相同m/z值的離子便會在同時抵達偵測器。

 

 

下面以分析胰島素的例子,說明反射式與直線式的MALDI-TOF得到的結果:

 

 

A:反射型的TOF,輕易區分出peptide中的12C和帶有放射性的13C

B:直線型的TOF,只能測出peptide的平均m/z值。

 

 

另一種改善直線型TOF缺點的方法是,使用間歇性雷射光讓樣品離子化,如此一來會延遲它們進入TOF的時間,使所有離子的起跑點一致,相同m/z值的就會在相同時間到達偵測器了。改良後的MALDI-TOF能區別m/z值只差0.001 amu的樣品。

 

在分析的時候,調整反射處(reflectron)的電壓,使peptide ion的加速度和電離(ionization)過程適時緩和下來,穿越TOF的時間不會太快也不會太慢,這種方法稱為PSDpost-source decay),雖然PSD不是分析peptide 序列最好方法,但是它可以測得完整的質量,尤其是H2N+=CHRR(氨基酸支鍊side chain)部份。

 

 

三、    MALDI的優缺點

 

世上並沒有完美的MS機種,但是MALDI-TOF MS有四大優勢:第一,操作簡便,它的操作介面人性化,使用者較易上手,是所有MS中最容易學會的一種,在資源共享的實驗團隊裡,它可以在一天之內分析上百件樣品。第二,需要大量製備蛋白質樣品的地方,目前從2D 電泳膠體的製作、蛋白質點(protein spots)的取出及酵素水解,都採用自動化的設備,MALDI-TOP也能以這樣的形式存在,減少人力、提高效率。第三,隨著TOF分析方式的改良,得到的蛋白質體數據也愈正確。第四,MALDI-TOF MS的靈敏度高,可以偵測到少量的(可到10-18 mole)蛋白質。

 

雖然MALDI-TOF MS有這麼多好處,有時我們仍會使用其它種類的MS,這是因為MALDI-TOF MS可以提供正確的「質量(mass)」資訊,卻不能獲得詳細的「序列(sequence data)」結果,PSD的改良固然使MALDI-TOF MS能看到序列,詳盡與正確度仍不及ESI tandem MSelectrospray ionization-tandem mass spectrometry)。除此之外,分析的成敗,幾乎取決於樣品當初製備的品質如何,如果樣品在水解過程被金屬、鹽類、尿素、丙醇污染,或是界面活性劑(detergen)沒有去除乾淨,都會使樣品在MALDI source的電離(ionization)受到極大的影響。當然,樣品的污染會影響所有的MS分析,不過MALDI-TOF MS對此特別敏感,因為它沒有再經HPLC系統去除雜質的步驟。

 

 

四、    ESI tandem MS

 

ESI-tandem MSelectrospray ionization-tandem mass spectrometry)又稱為ESI-MS-MSESI是離子產生的過程,tandem mass spectrometry是分析離子質量的地方,分為兩個或更多個步驟。和MALDI 中晶格化的樣品不同,ESI的樣品是放在溶液中的,溶液pH值的高低,控制了樣品的官能基(functional group)離子化的狀況,pH值約高於5C-terminal的部份才會離子化,pH值低於7的時候,N-terminal及氨基酸hitidine的氮才會游離,lysinearginineN端通常要低於pH8.5才會離子化,這表示在酸性溶液中(如pH3.5或更低)會使蛋白質帶正電,在鹼性環境中則讓蛋白質帶負電,ESI一般都在酸性環境下分析帶正電的peptide ion

 

在分析前,使用胰蛋白酶(trypsin)水解蛋白質的結果,因為酵素切點的位置,使作用完的peptides裸露出lysinearginine部份,加上低pH值的環境,這些peptides變成帶有多個正電的狀態。舉例來說,帶有一個質子的20kDam/z = 20,001)蛋白質,其實在溶液中可以接受10~30個質子,因此這些蛋白質分子有的含有20個質子,m/z值為20,020/20=1001;有的含有21個質子,m/z值是20,021/21=953;有的含19個質子,m/z值是20,019/19=1053ESI mass specgrum之所以被稱為「多價封套(multicharge envelope)」,正是因為它能捕捉到不同價數的蛋白質狀態,下圖是以此法分析牛的apomyoglobin結果:

 

 

 

再透過軟體,將這些訊息顯示為真正的蛋白質質量:

 

 

 

 

 

較小的蛋白質(250~2500 Da)依其大小及鹼性氨基酸多寡,通常以一至三價混合離子的形式存在,拿胰蛋白酶切完產生的peptide DAFLGSFLYEYSR」為例,ES-MS分析的結果如下:

 

 

 

一價的m/z1567.9,二價的離子m/z784.7

 

 

ESI source的構造較簡單,樣品通常由HPLC純化出來後,流入source的地方,經過高電壓的不繡鋼管或針頭,以滴狀物的形式噴出,每一滴都含有胜肽離子(peptide ions)和HPLC的移動相物質,如水、acetonitrile acetic acid等。接著,source以加熱或給予氮氣的方式,分開peptide ions與其它物質,將peptide ions送入analyzer分析,其他物質以抽真空的方式排出。整個流程如下圖所示:

 

 

 

 

 

五、    Tandem Mass Analyzers

 

 

在蛋白質體學研究中,目前有三種分析儀(analyzer)搭配ESI source使用,分別是triple quadrupole(又稱為triple quad)、ion trapquadrupole-time of flightQ-TOF)。三種的運作方式雖有差別,共同點是會選擇source送來的peptide ion 其中一種m/z值,以撞擊引發解離作用(collision-induced dissociationCID),peptide ion片段化且變成電中性,分析m/z值後產生離子光譜(ion spectrum),由tandem MS-MS光譜的資訊,可以推知peptide的序列,由MS-MS spectrum還可以知道序列的何處經過修飾。

 

Triple quad是首用於蛋白質體學研究的tandem MS,含有4個平行排列的金屬柱:

 

 

 

金屬柱的電流和電壓方向,使離子以螺旋狀軌道行進,唯有具備特定的m/z值的離子能穿越,大於或小於此m/z值的離子無法順利穿越:

 

 

source來的離子會先經過第一個quadrupoleQ1)作快速掃瞄(rapid scanning),記錄下所有時間通過的所有離子m/z值,這種模式為「full-scan mode」:

 

 

 

 

我們也可以調整Q1電壓,讓它成為一個「質量過濾器」(mass filter),只能讓特定的m/z值離子通過,這些離子進入第二個quadrupoleq2)後,經argon原子的碰撞而裂解化(fragmentation),在第三個quadrupoleQ3)分析m/z值,這種模式稱為「MS-MS mode」,MS-MS 分析的效果,和Q1電壓的設定、q2Ar 氣壓的大小、CIDcollision-induced dissociation)的能量給予,有很大的關聯性。它的流程如下:

 

 

 

Q-TOF triple quad大致相似,唯它的Q3部份是TOF mass analyzer

 

六、    Ion-Trap Mass Analyzers

 

 

Ion-trap mass analyzer的作用原理和triple quadrupoles有很大的不同,後者是在離子飛行穿越管子的時候分析它們,前者則是收集並儲存離子後再分析之。由 source來的離子會直接進入ion traptrap的兩端有電極,中間是環狀的電極,構造如下圖:

 

 

Trap的大小和葡萄差不多,它將收集到的離子保存在軌道上,以氦氣作冷卻劑,使離子的能量散佈均勻,並循序析出離子,:

 

 

為了呈現所有在trap中離子的質譜,它會不斷進行「讓trap充滿離子」、「依m/z值掃瞄出離子」的循環,和前面提過的triple quadrupole不同,triple quadurpole是作出連續性的分析,ion trap則是作有規律性的間歇式分析。當目標離子進入,trap的電壓會加高,使離子受到衝擊產生fragmentation

 

 

產生的fragmentstrap「捕捉」,依m/z值分析:

 

 

Ion-trap的解析力很高,如果將掃描的速度調慢,它能分辨0.05 unitm/z值差異,在自動化操作的過程中,若再搭配限制質量,甚至能在MS-MS分析前就得知離子的價數狀況(charge state),這對peptide的定序相當有利。

 

 

 

 

 

※參考資料: Daniel C. Liebler    Introduction to Proteomics-Tools for the New Bioloogy  P55~76

             Humana Press Inc. (2002)

 

整理: 施純如