膠體過濾法(Gel filtration

 

 

 

在這個部份,我們將分成四個方向介紹膠體過濾法:

 

1.      基本原理:簡介膠體過濾法的原理並以圖示說明。

2.      凝膠類型:包括3個主要常用的凝膠類型及特性。

3.      凝膠和管柱的選擇:如何依分離物質的性質選擇適當的凝膠和管柱大小。

4.      凝膠的處理:凝膠使用前後的準備與儲存方法。

 

 

一、基本原理

 

 

凝膠過濾法(gel filtration)也稱為排阻層析(exclusion chromatography)、凝膠層析(gel chromatography)或分子篩層析(molecular sieve chromatofraphy),它是在1960年後發展出來的技術。

 

凝膠是由膠體溶液凝結而成的固體物質,內部具有網狀篩孔,利用球狀凝膠內的篩孔,使分子流過填充凝膠的管柱時,大分子無法進入凝膠篩孔,而只流經凝膠及管柱間的孔隙,很快就可以流出管柱,較小的分子因為進入凝膠內的篩孔,故在管柱內的停留時間較長,由此區分大小不同的分子,亦可與已知大小的分子作比較而定出一分子的分子量。一般狀況下,凝膠不會吸附成份,所有欲分離物質都會被洗出,這是凝膠層析法與其它層析法不同的地方。

凝膠層析的過程如下:

 

 

 

 

 

二、凝膠類型

 

目前常用的凝膠包括3個主要類型:

 

1.      Polydextran

 

Polydextran的商品名稱是Sephadex,它幾乎不溶於溶劑中,親水性強,能迅速在水和電解質溶液中膨脹,在鹼性的環境中十分穩定,所以可以用鹼去除凝膠上的污染物。Sephadex依其吸水量有不同型號,如 G-25G-75G-100或是G-200G 後面的數字為凝膠吸水量再乘以10,以G-25為例,表示1克乾燥的G-25凝膠可以吸水2.5 ml

 

2.      Polyacrylamide

 

Polyacrylamide是一種合成凝膠,商品名Bio-Gel P,乾粉顆粒狀,在溶劑中自動溶成膠體,依膠的分離範圍不同,分成Bio-Gel P-2Bio-Gel P-300P後面的數字乘以1000為最大過濾限度。Polyacrylamide的化學性質不活潑,但它在極端的pH 下會被水解,水解後產生的COOH-具有離子交換的性質,因此pH 值應盡量控制在2-10之間。

 

3.      Agarose

 

商品名Separose,屬於天然凝膠,依凝膠中乾膠的百分含量,分為Sepharose 2B4B6BAgarose gel 是一種大孔凝膠,主要用於像核酸或病毒這些分子量400,000以上的物質,因其顆粒軟,在分離過程有時會阻塞管柱,造成流速減慢,又因其在攝氏50度以上會融化,故需於較低溫的環境中進行層析。Agarose 做成beads後不能再脫水乾燥,所以要在溼態中保存。

 

 

三、凝膠和管柱的選擇

 

凝膠的材質需為化學惰性,與分離物不能產生變性(denature)或是其它化學反應,最好具有能長期反覆使用的穩定性,並可以在較大的pH和溫度範圍內使用。由於凝膠上的離子交換基團會吸附帶電荷的物質,產生離子交換的效果,所以凝膠上最好不具有離子交換的基團。此外,凝膠要有一定的機械強度,在層析過程中才不會變形,增加機械強度也可使層析在較高壓力的環境進行,縮短分離時間。

 

凝膠顆粒的粗細與分離效果有直接關係,顆粒細的分離效果好,但流速慢而費時,因此要依據實際的需要來選擇。對於分子量較小的物質,一般採用polydextranpolyacrylamide材質的凝膠,大分子物質則使用agarose

 

Sephadex為例,Sephadex G-50可用於區分分子量1,500~30,000之分子,而Sephadex G-75 凝膠可區分分子量3,000~70,000之分子,所以若要分離分子量10,00020,000之分子,兩種都適用。

 

如果要分離的分子大小相差很多,則可選用柱高:直徑=51~151的管柱,且管柱體積要大於4~15倍的樣品體積;如果要分離的物質之間分子量差異不大,則要選用柱高:直徑=201~1001的管柱,且管柱體積要大於25~100倍的樣品體積。

 

 

四、凝膠的處理

 

商品凝膠一般是乾燥的顆粒,使用前要先泡在欲使用的沖洗液中,使它充份膨脹,否則有引起凝膠柱破裂的危險。熱脹法是常用的前處理法,即把浸於沖洗液中的凝膠加熱,讓它膨脹並除去氣泡,溫度夠高的話(加溫至近沸騰)也可消毒殺菌。凝膠處理過程不能劇烈攪拌,如此易使顆粒破裂,影響流速。

 

將凝膠裝入管柱的方法有很多種,實驗室常用的方法是先在柱中加入約1/3 體積的沖洗液,邊輕輕攪伴邊將凝膠懸浮液倒入其中,等到底部沉積約1~2公分的凝膠後,打開下方出口讓水流出,上面不斷加入懸浮液,等到沉積到離頂部約3~5公分處停止,讓3~5倍柱床體積的緩衝液流過層析柱。若用polydextran的凝膠,可放入有顏色的蛋白質(如cytochrome c)流過管柱,看看色帶是否均勻下降,不均勻或出現氣泡,凝膠均需倒出重新填裝。

 

衝洗緩衝液僅需留高於柱床2 公分左右,多餘的可用滴管吸去,再將出口打開使衝洗液流到距表面1~2公釐,關閉出口,用滴管緩緩加入樣品再打開出口,樣品完全滲入凝膠內後,加入約4公分衝洗液,出口處接上收集瓶開始層析。

 

由於polydextran agarose都屬於多醣類,一旦微生物生長過多,分泌的酶會水解凝膠使其性質改變,為了防止這種情況發生,凝膠最好採用真空或低溫保存,但溫度不能過低使凝膠凍結。加入抑菌劑(chlohexidine, chlorbutol, phenylmercuric salts, NaOH等)也是常用的方法。長時間不用的凝膠可用乾燥保存法,也就是把使用過的凝膠用水除去碎顆粒和雜質,再用不同濃度的酒精,由70%90%95%逐步脫水,在攝氏60~80度下烘乾,不能加熱的Sepharose則用乙醚洗滌乾燥。

 

 

 

 

 

 

 

參考資料:李建武等合編   生物化學實驗原理和方法  P77~93     藝軒圖書出版社  (1999)